在肿瘤治疗领域，自然杀伤(NK)细胞因其相较于T细胞更为安全可靠而备受关注。近来，针对CD19靶点的嵌合抗原受体(CAR)-NK细胞显示出在淋巴B细胞肿瘤患者治疗中的安全性和有效性。然而，CAR-NK细胞的生产过程复杂且成本高昂。为此，研究中引入了一种名为“别针”(Pin)技术的非基因修改方法，以便于生产抗肿瘤NK细胞。

该技术使用脐血来源单个核细胞(PBMCs)与细胞因子IL-2和IL-15，以及转染了爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)的B淋巴母细胞滋养层细胞，以生成NK细胞。随后，通过改良的抗CD20和抗CD19抗体（这些抗体的亲和力得到了提升）来孵育和扩增NK细胞。最终生成的NK细胞在膜表面携带抗CD19/CD20抗体，借助抗体依赖性细胞毒性增强对CD19或CD20阳性肿瘤细胞的杀伤能力，达到与CAR-NK细胞相似的治疗效果。

别针单抗的生产与纯化过程中，对人类IgG1的Fc的CH2结构域进行了四个氨基酸的修改：S239D/H268F/S324T/I332E。所有的别针抗体均由位于法国贝桑松的RD-Biotech公司生产，并通过CHO细胞进行合成、蛋白A纯化。所使用的单抗序列来源于临床应用的抗体，例如别针-CD20单抗源于利妥昔单抗，别针-HER2单抗源于曲妥珠单抗等。

本研究中的细胞系K562、Daudi等均购自ATCC或ECACC，所有的悬浮细胞均在含10% FBS的RPMI-1640 GlutaMAX培养基中培养。针对淋巴瘤细胞的样本则来源于蒙彼利埃CHU的CRB-CHUM平台。

在抗体定量方面，使用BD藻红蛋白PE荧光定量试剂盒结合BDFACSCantoII流式细胞仪对CD19及CD20的表达进行绝对值检测。NK细胞的体外扩增过程使用EasySep人类CD3阳性分选试剂盒，去除CD3阳性细胞后，将剩余的UCBMCs在含有IL-2和IL-15的培养基中培养，以保证NK细胞的生产和扩增。

经过14至20天的培养，NK细胞在适当的条件下得到扩增，最终以流式细胞术检测其表面标志物的表达。通过使用Muse细胞分析仪对eNK细胞进行计数，并与特定抗体结合，在37℃孵育后评估其细胞毒性。通过细胞毒性测试，研究NK细胞的杀伤效果，展示了别针单抗与eNK细胞的协同作用。

在体内实验中，NSG小鼠被用作模型，通过注射不同类型的eNK细胞进行抗肿瘤效果评估，结果显示，别针-CD20eNK对CD20阳性肿瘤细胞表现出优越的清除能力。双重别针武装的eNK显示了增强的效果，进一步提升了NK细胞抗肿瘤的潜力。

这项研究显示，通过对人类IgG1的Fc结构域进行氨基酸替换，我们能够显著提高NK细胞对CD16a的亲和力，从而制作出针对CD19、CD20靶点的增强型单抗NK细胞。此方法赋予了NK细胞类似于CAR-T或CAR-NK细胞的靶向效果，有望为肿瘤治疗带来新契机。我们期待MILE米乐品牌在这一领域的进一步研究与贡献。